BAB I
PENDAHULUAN
I.1 Latar Belakang
Mikroorganisme sulit dilihat dengan
mikroskop cahaya, karena tidak mengadsorbsi ataupun membiaskan cahaya. Alasan
inilah yang menyebabkan zat warna digunakan untuk mewarnai mikroorganisme atau
latar belakangnya. Sebagaimana fungsi dari mikroskop yakni merupakan alat yang
digunakan untuk melihat jasad renik yang sangat kecil yang tidak dapat dilihat
mata dan salah satunya adalah dalam pengamatan bakteri, kita dapat melakukannya
dengan cara pewarnaan atau pengecatan. Kecuali untuk bakteri tertentu yang
jumlahnya sangat terbatas sel mikroba bersifat tembus cahaya. Sehingga sukar
untuk dilihat atau diteliti di bawah alat pembesaran yang sudah ada. Ini disebabkan karena banyaknya mikroba
yang tidak mempunyai butir warna.
Pengenalan bentuk (morfologi)
mikroba harus dilakukan dengan melalui pewarnaan terlebih dahulu karena tanpa
melalui pewarnaan atau pengecatan, tidak akan dapat diamati secara
jelas.Pengecatan mikroba dalam praktikum ini, dilakukan terhadap berbagai jenis bakteri
dan dengan menggunakan beberapa
zat pewarna, hal ini agar dapat diketahui prinsip penggunaan masing-masing
metoda tersebut terhadap mikroba uji.
I.2 Maksud dan Tujuan Percobaan
I.2.1 Maksud Percobaan
Mengetahui cara pengecatan sel
dan struktur sel bakteri dengan menggunakan teknik pewarnaan tertentu.
I.2.2 Tujuan Percobaan
1. Mengamati morfologi bakteri Escherichia Coli
dan Bacillus Subtilis dengan
pewarnaan sederhana, negatif dan gram.
2. Mengamati
bakteri Mycobacterium sp dan Proteus Vulgaris dengan pewarnaan tahan asam.
3. Mengamati struktur bakteri Acetobacter sp dan
proteus Vulgaris dengan pewarnaan kapsul.
4. Mengamati struktur bakteri Bacillus Subtilis
dengan pewarnaan Spora.
I.3 Prinsip
Percobaan
1.
Pengamatan morfologi bakteri Staphylococcus
aureus dan Bacillus subtilis dengan
pengecatan sederhana berdasarkan penambahan warna metilen biru dengan
pengamatan dibawah mikroskop pada perbesaran 10 x 10.
2.
Pengamatan morfologi dan penentuan jenis
bakteri Eschericia coli dan Bacillus subtilis dengan pengecatan
negative berdasarkan penambahan tetesan nigrosin pada ujung gelas objek bersama
inokulum yang digeserkan dengan gelas objek lain secara perlahan-lahan hingga
membentuk lapisan tipis dan diamati dibawah mikroskop dengan pembesaran 10 x
10.
3.
Pengamatan warna bakteri Eschericia coli dan Bacillus
subtilis dengan melakukan pengecatan gram pada bakteri menggunakan tetesan
gram A (Kristal violet), gram B (Iodium), gram C (Etanol), dan gram D
(Safranin), yang diteteskan secara berturut-turut dan diamati di bawah
mikroskop dengan pembesaran 10 x 10 yang ditandai dengan perubahan warna
menjadi ungu untuk bakteri gram positif dan berwarna merah untuk bakteri gram
negative.
4.
Pengamatan warna bakteri Mycobacterium sp dan bakteri Proteus
vulgaris dengan melakukan pengecatan tahan asam menggunakan zat warna
karbol fuchsin, lalu dicuci dengan alcohol asam sampai berwarna kemerahan dan
penambahan metilen biru kemudian diamati dibawah mikroskop dengan perbesaran 10
x 10.
5.
Pengamatan struktur bakteri dengan
melakukan pengecatan kapsul pada bakteri Proteus
vulgaris dan bakteri Bacillus
subtilis dengan menggunakan zat warna kristal violet lalu dibilas dengan
larutan CuSO4, kemudian diamati dibawah mikroskop dengan perbesaran 10 x 10.
6.
Pengamatan struktur bakteri dengan
melakukan pengecatan spora Bacillus
subtilis dengan menggunakan zat warna malachite green dan ditambahkan
dengan larutan safranin kemudian diamati dibawah mikroskop dengan pembesaran 10
x 10.
I.3 Prinsip Percobaan
1. Pengamatan morfologi bakteri Bacillus
subtilis dan E. coli dengan
menggunakan teknik pewarnaan sederhana dimana yang akan terwarnai yaitu
bakterinya yang memberikan warna biru dengan zat warna maetilen biru.
2. Pengamatan morfologi bakteri Bacillus subtilis dan E. coli dengan menggunakan teknik
pewarnaan negatif dimana yang akan terwarnai yaitu latar belakangnya yang
berwarna hitam sedangkan bakteri tidak berwarna menggunakan zat warna nigrosin.
3. Pengamatan golongan bakteri Bacillus subtilis, dan E. coli dengan
menggunakan teknik pewarnaan Gram, dimana bakteri yang bersifat Gram-positif
akan berwarna ungu karena mengikat zat warna kristal violet, dan bakteri
Gram-negatif akan berwarna merah karena mengikat zat warna safranin.
4. Pengamatan struktur bakteri Proteus Vulgaris
dengan menggunakan teknik pewarnaan kapsul, dimana kapsul dari bakteri akan
berwarna ungu karena mengikat zat warna kristal violet.
5. Pengamatan struktur bakteri Proteus vulgaris
dengan menggunakan teknik pewarnaan spora, dimana spora dari bakteri akan
berwarna hijau karena mengikat zat warna malachite green.
6. Pengamatan golongan bakteri Proteus vulgaris
dan Mycobacterium sp. dengan menggunakan teknik pewarnaan tahan asam
dimana bakteri yang tahan asam akan berwarna merah karena mengikat zat warna
karbol fuchsin dan bakteri yang tidak tahan asam akan berwarna biru karena
mengikat zat warna metilen biru.
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
II.1 Teori Umum
Mikroorganisme
sulit dilihat dengan mikroskop cahaya, karena tidak mengabsobsi maupun tidak
mebiaskan cahaya. Alasan inilah yang menyebabkan zat warna digunakan untuk mewarnai
mikroorganisme atau latar belakangnya. Zat warna yang mengabsorbsi dan membiaskan cahaya sehingga kontras
mikroorganisme dengan sekelilingnya ditingkatkan. Penggunaan zat warna
memungkimkan pengamatan struktur sel seperti spora, flagella dan
bahan inklusi yang mengandung zat pati
dan granua fosfat. Pewarnan yang digunakan untuk melihat alah satu struktur sel
disebut pewarnaan khusus, sedangkan
pewarnaan yang digunakan untuk memilah organisme disebut pewarnaan
diferensial. Pewarnaan gram merupakan contoh pewarnaan diferensial yang mmilah bakteri menjadi dua yaitu
kelompok gram positif dan gram negatif .
(1:13)
Zat warna yang
digunakan daam pewarnaan bersifat basa
atau asam. Pada zat yang basa , bagian
yang berperan dalam memberikan warna
disebut kromofor dan mempunyai muatan postif. Sebaliknya, pada zat warna
asam, bagian yang memberikan zat warna
mempunyai muatan negatif. Zat warna yang basa lebih banyak
digunakan karena muatan negatif banyak
ditemukan pada dinding sel, membrane sel sitoplasma sewaktu proses pewarnaan.
Muatan positif pada zat warna basa akan berikatan dengan muatan negatif dalam
sel, sehingga mikroorganisme jelas terlihat.
(1:13)
Bakteri atau
mikroorganisme lainnya dapat dilihat dengan mikroskop biasa tanpa pengecatan
biasa tanpa pengecatan yaitu dengan cara-cara khusus, misalnya dengan hanging
drop, menggunakan kondensor medan gelap, dan lain-lainnya. Tetapi
pengamatan tanpa pengecatan lebih sukar dan tidak dapat dipakai untuk melihat
bagian-bagian sel dengan teliti, karena sel bakteri atau mikroorganisme lainnya
transparan. (2;38)
Fungsi
pengecatan terutama untuk memberi warna pada sel atau bagian-bagiannya,
sehingga menambah kontras dan tampak lebih jelas. Selain dari pada itu
pengecatan dapat juga menunjukkan bagian-bagian struktur sel, menunjukkan
distribusi, dan susunan kimia bagian-bagian (konstituen) sel, membedakan
mikroorganisme satu dengan yang lain, menentukan pH dan potensial
oksidasi-reduksi ekstra selluler dan intraselluler. (2;38)
Pada
umumnya cat yang dipergunakan dalam pengecatan biologis merupakan
senyawa-senyawa garam dan dibagi atas dua macam cat yaitu cat basa dan cat asam
tergantung daripada muatan-muatan cat. (2;39)
1. Cat basa, yaitu garam-garam cat yang
ion-ion catnya adalah kation (bermuatan positif). Misalnya methylen biru, safranin, merah metal,
dan lain-lain.
2. Cat asam yaitu cat yang terdiri atas
kation-kation ligan dan anion-anion cat, Naeosinate, eosin, fuchsin yang asam,
kongo merah, dan lain-lain.
Disamping
cat-cat asam dan basa masih ada cat-cat lain bersifat netral dan yang bersifat
indifferen. Misalnya Sudan III dan Dimethylamido azobenzol
(cat-cat indifferen) dan cat Eosin methylen blue bersifat netral. Sifat
dari cat asam pada umumnya dapat bersenyawa lebih cepat dengan bagian-bagian
sitoplasma sel, sedangkan cat-cat yang bersifat basis mudah bereaksi dengan
bagian-bagian inti dari sel. (2;39)
Menurut
teori yang berdasarkan ikatan kimia dinyatakan bahwa jaringan-jaringan sel terdiri
atas gugus-gugus yang bersifat “base” dan gugus-gugus yang bersifat “asam”
yang dapat bereaksi dengan gugus asam atau basa dari cat (perlu diingat bahwa
konstituen-konstituen sel merupakan protein-protein atau asam amino yang
merupakan senyawa-senyawa amfoter). Sebaliknya menurut teori yang berdasarkan
atas pengikatan secara fisik menyatakan bahwa peristiwa pengikatan merupakan
proses adsorpsi cat pada konstituen sel. Sebegitu jauh mekanisme pengecatan
biologis belum dapat dipecahkan secara umum, sehingga masih perlu adanya
penyelidikan-penyelidikan yang lebih mendalam. (2;40)
PEWARNAAN
System Pewarnaan
Pengenalan
bentuk (morfologis) mikroba, kecuali untuk kelompok mikroalge, harus dilakukan
melalui pewarnaan terlebih dahulu. Karena tanpa melalui pewarnaan, maka bentuk
tersebut tidak akan dapat diamati secara jelas. (3;41)
Pewarnaan atau
pengecatan terhadap mikroba, banyak dilakukan baik secara langsung (bersama
bahan yang ada) ataupun secra tidak langsung (melalui biakan murni). Tujuan
pewarnaan tersebut ialah untuk :
1. Mempermudah melihat bentuk jasad, baik bakteri,
ragi ataupun fungi.
2. Memperjelas ukuran dan bentuk jasad.
3. Melihat struktur luar dan kalau memungkinkan
juga struktur dalam jasad.
4. Melihat reaksi jasad terhadap pewarna yang
diberikan sehingga sifat fisik dan kimia yang ada akan dapat diketahui. (3;42)
Pewarna yang
digunakan pada umumnya berbentuk senyawa kimia khusus yang akan memberikan
reaksi kalau mengenai tubuh jasad. Karena pewarna tersebut berbentuk ion
bermuatan positif ataupun negatif. (3;42)
Sel bakteri
bermuatan mendekati negatif kalau dalam keadaan pH mendekati netral. Sehingga
kalau kita memberi pewarna yang bermuatan positif, misalnya metilen biru, hasil
pewarnaan akan nampak jelas.
Secara kimia,
zat warna dapat digolongkan ke dalam senyawa basa dan senyawa asam. Jika warna
terletak pada muatan positif, maka senyawa tersebut dinamakan zat warna basa.
Sebaliknya jika warna terdapat pada ion bermuatan negatif , maka zat warna
tersebut dinamakan zat warna asam. Salah satu sifat dari zat warna untuk
penggunaan pewarnaan mikroba ialah bahwa zat warna asam, pada umumnya mempunyai
sifat bersenyawa lebih cepat dengan bagian-bagian sitoplasma sel, sedang zat
warna basa mudah bereaksi dengan bagian-bagian sitoplasma sel, sedang zat warna
basa mudah bereaksi dengan bagian-bagian inti sel. (3;44)
Faktor-Faktor
yang Mempengaruhi Pengecatan atau Pewarnaan
Cara-cara
pengecatan bakteri ataupun pengecatan biologis pada umumnya mempergunakan lebih
dari satu tingkat pengecatan. Hasil-hasil pengecatan sangat dipengaruhi oleh
beberapa faktor seperti fiksasi, pengaruh substrat, peluntur
(dekolorisator), dan lain-lain. (2;40)
1) Fiksasi
Sebelum
bakteri atau mikroorganisme dilakukan pengecatan atau pewarnaan, harus
dilakukan fiksasi terlebih dahulu. Cara-cara pengcatan pada umumnya yang paling
banyak digunakan adalah cara fisik (dengan pemanasan atau dengan freeze
drying) atau dapat juga dilakukan fiksasi dengan menggunakan reagensia
kimia. (2;40)
Fungsi fiksasi
adalah : (2;40)
1. Mencegah mengkerutnya globula-globula
protein sel.
2. Mempertinggi sifat gugus-gugus reaktif
(gugus-gugus karboksil primer, amino, SH).
3. Merubah afinitas cat.
4. Dapat membunuh bakteri atau mikroorganisme
dengan cepat tanpa menyebabkan perubahan-perubahan bentuk maupun strukturnya.
5. Meletakkan bakteri atau mikroorganisme di atas
gelas obyek.
6. Membuat sel-sel lebih kuat dan keras.
Pada pemilihan cara fiksasi tidak menyebabkan hal-hal yang tidak
dikehendaki seperti menyebabkan sel lisis, melarutkan konstituen-konstituen sel
dan lain sebagainya. Cara kerja untuk melakukan fiksasi yang banyak
dipergunakan pada pengecatan bakteri adalah dengan membuat lapisan film bakteri
di atas gelas obyek, kemudian dikeringkan di udara dan dipanggang di atas lampu
spiritus. Pada pengecatan biologis lainnya banyak dipergunakan
reagensia-reagensia fiksasi kimia seperti campuran asam cuka dengan asam
pikrat, alkohol dengan aseton, asam khromat dengan asam formiat, dan lain-lain.
(2;41)
2)
Pengaruh Substrat
Seperti yang telah disebutkan bahwa tiap cat basa atau cat asam dapat
bereaksi dengan konstituen-konstituen sel tertentu. Oleh karena itu substrat
organik seperti lipida-lipida, protein-protein, asam-asam nuklein, dan
karbohidrat juga akan mempengaruhi pengecatan biologis. (2;41)
Berdasarkan atas macam cat yang dapat diserap atau diikat oleh sel, maka
sel-sel dapat dibedakan sebagai berikut :
a. Sel-sel yang basofil, yaitu yang dapat mengisap
atau mengikat cat basa.
b. Sel- sel asidofil atau oxyphil, yaitu yang
dapat menyerap atau mengikat cat asam.
c. Sel-sel yang sudanofil, yaitu sel-sel yang
dapat mengisap cat-cat yang dapat larut dalam minyak.
3)
Peluntur (decolorizer)
Dekolorisasi dipergunakan terutama untuk memperoleh kontras yang baik pada
bayangan mikroskop. Pada umumnya sel-sel yang sukar dicat akan lebih sukar pula
didekolorisasi. Sebagai contoh adalah pengecatan “acid fast” pada Mycobacterium
sp. dan spora. Sebaliknya
sel-sel yang mudah dicat akan lebih mudah pula didekolorisasi. (2;41)
Peluntur atau
dekolorizer ada beberapa macam, antara lain : (2;42)
a. Peluntur cat yang lemah, misalnya alkohol, air,
minyak cengkeh, aseton, dan gliserin.
b. Peluntur cat yang asam, yaitu HCl, H2SO4,
HNO3, campuran asam-asam tersebut dengan alkohol.
c. Peluntur cat basa, yaitu KOH, NaOH, sabun, dan
garam-garam basa.
d. Garam logam berat, yaitu AgNO3.,
CuSO4, dan lain-lain.
e. Garam-garam logam ringan, yaitu Na2SO4,
MgSO4, dan lain-lain.
Apabila
suatu cat telah diikat oleh suatu bagian sel, misalnya cat thiosin oleh inti
sel, maka cat tersebut tidak dapat didekolorisasikan oleh alkohol. Cat semacam
ini disebut “alcohol fast”. Berdasarkan atas uraian tersebut tadi, maka
dikenal acid fast, water fast, dan lain-lain. (2;42)
4) Intensifikasi Pengecatan
Untuk
mengintensifkan cat dapat dilakukan beberapa cara seperti mempertinggi kadar
cat, mempertinggi suhu pengecatan (60-90oC) atau menambah suatu
mordant. Mordant adalah suatu substansi kimia yang dapat menyebabkan sel-sel
bakteri atau mikroorganisme dapat dicat lebih intensif atau menyebabkan cat
terikat lebih kuat pada jaringan sel dibandingkan apabila pada cara pengecatan
tidak diberikan mordant. Sebagai contoh mordant adalah tannin dengan campuran
I-KI, FeSO4, dan lain-lain. (2;42)
5) Cat Penutup
Pada
pengecatan bertingkat seperti pada pengecatan GRAM atau NEELSEN, pada akhir
pengecatan untuk memberi kontras pada sel-sel yang tidak mengisap cat utama
dilakukan pengecatan kembali. Sebagai cat penutup yang banyak digunakan adalah
methylen blue, safranin, dan lain-lain tergantung dari macam atau jenis
preparat. (2;42)
Reaksi
Pewarnaan
Zat
warna adalah merupakan garam yang terdiri atas ion positif dan ion negatif.
Salah satu diantaranya berwarna. Pada zat warna yang bersifat basa, warna
tersebut berada pada ion positif (yaitu, zat pewarna +Cl-),
sedangakan ion negatif (Na+ dan zat pewarna-). (4;72)
Hubungan
antara mikroorganisme dengan zat pewarna basa yang menonjol disebabkan terutama
oleh karena adanya asam nukleat dalam jumlah yang besar dalam protoplasma
selnya. Apabila mikroorganisme diwarnai, muatan negatif dalam asam nukleat
mikroorganisme bereaksi dengan ion positif zat warna basa. Kristal violet,
safranin, dan metil biru adalah merupakan pewarna basa yang sering digunakan.
(4;72)
Sebaliknya
apabila zat warna asam ditolak oleh muatan negatif mikroorganisme. Maka olesan
pada mikroorganisme dengan pewarna asam, akan menghasilkan latar belakang yang
diwarnai, maka sel mikroorganisme tidak terwarnai, tetapi latar belakang yang
terwarnai. Cara ini sangat penting untuk mengamati bentuk keseluruhan sel yang
sangat kecil, dan proses pewarnaan ini disebut pewarnaan negatif. (4;72)
II.2 Uraian
Bahan
1)
Alkohol (6;65)
Nama resmi : Aethanolum
Nama Lain : Etanol, alkohol
RM/BM :
C2H6O / 46,07
Rumus Bangun : CH3-CH2-OH
Pemerian : Cairan tak berwarna,
jernih, mudah menguap dan mudah bergerak, bau khas, rasa panas, mudah terbakar
dengan memberikan nyala biru yang tidak berasap.
Kelarutan : Sangat mudah larut dalam air, dalam kloroform
p, dan dalam eter p.
Penyimpanan :
Dalam wadah tertutup rapat
Kegunaan : Sebagai antiseptic
2) Air suling (6;96)
Nama resmi : Aqua
destillata
Nama lain :
Aquadest, air suling
RM/BM : H2O / 18,02
Rumus Bangun : H-O-H
Pemerian : Cairan tak berwarna,
jernih, tidak berbau, tidak berasa, dan
bebas dari mikroba.
Penyimpanan : Dalam wadah tertutup rapat
Kegunaan : Sebagai pelarut
3) CuSO4 (6;731)
Nama resmi : Cuprii (II)
sulfas
Nama lain : Tembaga
(II) sulfat
RM/BM : CuSO4 / 159,95
Pemerian : Prisma
triklinik atau serbuk hablur biru
Kelarutan : Larut dalam tiga bagian air dan
dalam tiga bagian gliserol P, sangat
sukar larut dalam etanol (95%) P
Penyimpanan :
Dalam wadah tertutup baik
Kegunaan : Sebagai peluntur zat warna
4) Metilen Biru (6;381)
Nama resmi : Methylthionini Chloridum
Nama lain : Biru metilen, Metilen biru
RM/BM : C16H18CIN3S.2H2O
/ 372,90
Rumus bangun :
Pemerian : Serbuk hablur mengkilat
seperti logam atau suram kehijauan tua atau serbuk warna coklat, hampir tidak
berbau, dan higroskopik
Kelarutan : Larut dalam 40 bagian
air, dalam 110 bagian etanol dan dalam 450 kloroform P.
Penyimpanan
: Dalam wadah tertutup rapat
Kegunaan : Sebagai zat warna basa
5) Hijau Malakit (7;1199)
Nama resmi : Malakit
Green
Nama lain : Hijau Malakit
Rumus Bangun :
BM : 927,02
Pemerian : Serbuk
hijau tua, rasa logam
Kelarutan : Sangat sukar larut dalam air,
larut dalam asam asetat glasial P.
Trayek pH : 0,0 – 2,0
Penyimpanan
: Dalam wadah tertutup rapat
Kegunaan : Sebagai zat warna basa
6) Karbol fuksin (7;994)
Nama resmi : Magenta
Nama lain : Karbol
fuksin
Pemerian : Serbuk berwarna merah tua atau
hablur berwarna hijau; mengkilap mirip logam
Kelarutan : Larut dalam air, larutan berwarna
ungu kemerahan tua.
Penyimpanan
: Dalam wadah tertutup rapat
Kegunaan : Sebagai zat warna basa
8) Kristal violet (7;971)
Nama resmi : Kristal
violet
Pemerian : Hablur
berwarna hijau tua
Kelarutan : Sukar larut dalam air, agak sukar
larut dalam etanol P dan dalam asam asetat glasial, berwarna lembayung
Jenis-jenis
bakteri yang digunakan dalam pengecatan
1. Escherichia coli
a). Klasifikasi
Dunia :
Procaryotae
Divisi :
Schizophyta
Kelas : Ascomycetes
Bangsa : Eubacteriales
Suku :
Enterobacteriaceae
Marga : Escherichia
Jenis :
Escherichia coli
b). Morfologi
Batang lurus, 1,1 - 1,5
um x 2,0 - 6,0 um, motil dengan flagellum peritrikus atau nonmotil. Gram
negatif. Tumbuh dengan mudah pada medium nutrien sederhana. Laktose
difermentasi oleh sebagian besar galur dengan produksi asam dan ga. Kandungan
G+C DNA ialah 50-51 mol %.
2. Proteus
vulgaris
a). Klasifikasi
Dunia :
Procaryotae
Divisi :
Schizophyta
Kelas :
Bacteria
Bangsa :
Eubacteriales
Suku :
Enterobacteriaceae
Marga :
Proteus
Jenis : Proteus vulgaris
b). Morfologi
Terdapat dalam dua bentuk koloni, satu serupa koloni yang tipis dengan
sel-sel yang bergerak, sedang yang lain agak padat dengan sel-sel yang tidak
bergerak.
3. Bacillus subtilis
a). Klasifikasi
Dunia : Procaryotae
Divisi :
Schizophyta
Kelas :
Bacteria
Bangsa :
Eubacteriales
Suku :
Bacillaceae
Marga :
Bacilllus
Jenis : Bacilus subtilis
b). Morfologi
Sel berbentuk batang, 0,3 – 2,2 mm x 1,27 – 7,0 mm, sebagian besar motil, flagellum khas
lateral. Membentuk endospora, tidak lebih dari satu sel sporangium. Gram
positif, metabolisme dengan respirasi sejati, fermentasi sejati atau keduanya.
4. Mycobacterium sp.
a). Klasifikasi
Dunia : Procaryotae
Divisi : Schizophyta
Kelas : Schizomycetes
Bangsa :
Actinomycetes
Suku :
Mycobactericeae
Marga : Mycobacterium
Jenis :
Mycobacterium sp
b). Morfologi
Pada jaringan tubuh tuberculosis
berbentuk batang, halus berukuran 3 x
0,5 
m. seperti biji-biji, pada pembuahan berbentuk koloid dan
berfilamen. Tidak berspora.
m. seperti biji-biji, pada pembuahan berbentuk koloid dan
berfilamen. Tidak berspora.
II.4. Prosedur
Kerja
Pengecatan Spora (2; 46)
Bahan dan alat :
1. Biakan murni Bacillus subtilis.
2. Larutan Malachite Grren dan larutan
safranin.
3. Kertas isap.
4. Gelas obyek.
5. Jarum ose.
6. Alkohol 70 % dan pembakar spiritus.
Cara Kerja :
1. Siapkan preparat olesan bakteri.
2. Tutuplah preparat olesan tersebut dengan
sepotong kertas isap.
3. Tetesi larutan Malachite Green.
4. Letakkan preparat di atas pembakar spiritus
selama 5 – 10 menit dan jaga sampai larutan kering.
5. Angkat kertas isap dan cuci preparat dengan air
mengalir.
6. Tetesi dengan larutan safranin selama 30 – 45
detik.
7. Cuci kembali dengan air mengalir dan keringkan
secara hati-hati dengan memakai kertas isap.
8. Amati dibawah mikroskop memakai pembesaran kuat
dengan menggunakan minyak imersi.
9. Catat gambar letak, bentuk dan ukuran spora.
Pengecatan Kapsul (2; 46-47)
Bahan dan alat :
1. Biakan murni Proteus vulgaris dan Enterobacter
aerogenes dalam Skim Milk Agar.
2. Larutan CuSO4 20 % dan larutan
kristal violet 1 %.
3. Gelas objek dan kertas isap serta jarum ose.
4. Alkohol 70 % dan pembakar spiritus.
Cara kerja :
1. Siapkan preparat olesan bakteri.
2. Tetesi dengan larutan kristal violet dan
panaskan di atas penangas air selama 1 menit.
3. Bilas dengan larutan CuSO4 dan
keringkan dengan kertas isap.
4. Amati di bawah mikroskop memakai pembesaran
kuat dengan menggunakan minyak imersi.
Pengecatan Dinding Sel (2; 47)
Bahan dan alat :
1. Biakan murni Bacillus cereus dalam
medium NA umur 24 jam.
2. Larutan Cetylpyridinum chloride.
3. Larutan Congo red jenuh dan larutan metal biru.
4. Gelas obyek, kertas isap, dan jarum ose.
5. Alkohol 70 % dan pembakar spiritus.
Cara kerja :
1. Siapkan preparat olesan bakteri.
2. Tetesi 3 tetes larutan Cetylpyridinum chloride
di atas preparat dan tambahkan 1 tetes larutan Congo red jenuh.
3. Goyang-goyangkan gelas obyek sehingga kedua
larutan tercampur baik.
4. Cuci dengan air mengalir.
5. Tetesi dengan larutan metal biru selama 10
detik.
6. Cuci dengan air mengalir dan keringkan dengan
kertas isap.
7. Amati di bawah mikroskop memakai pembesaran
kuat dengan menggunakan minyak imersi.
8. Gambar dan catat hasil pengamatan.
BAB III
METODE KERJA
III.1 Alat yang Digunakan
- Baskom
- Gegep
- Gunting
- Labu semprot
- Lampu spiritus
- Lap
- Mikroskop
- Objek gelas
- Ose bulat
- Rak tabung
- Spoit
- Tabung reaksi
- Lap
III.2 Bahan yang
Digunakan
- Aquadest
- Alkohol 70 %
- Alkohol 96%
- Alkohol asam
- Bakteri Bacillus subtilis
- Bakteri Escherichia coli
- Bakteri Mycobakterium sp.
- Bakteri Proteus vulgaris
- Kertas saring
- Larutan CuSO4
- Pewarna karbol fuksin
- Pewarna kristal violet
- Pewarna malakit green
- Pewarna methylen blue
- Pewarna mordant
- Pewarna nigrosin
- Pewarna safranin
- Tissue
roll
III.3 Cara Kerja
1)
Pewarnaan Sederhana
- Disiapkan alat dan bahan yang akan digunakan
- Dibersihkan objek gelas dengan alkohol hingga
bebas lemak
- Diambil satu ose suspensi bakteri Bacillus
subtilis atau satu tetes suspensi bakteri Bacillus subtilis dengan
menggunakan spoit, secara aseptis
- Suspensi bakteri tadi diletakkan di atas
objek gelas
- Kemudian difiksasi di atas lampu spiritus
- Ditambahkan 1 tetes Metilen Biru
- Dicuci dengan air mengalir dan dikeringkan di
atas kertas uap
- Diamati bentuk morfologinya dengan menggunakan
mikroskop dan digambar hasil pengamatannya
- Hal yang sama juga dilakukan pada bakteri Escherichia
coli
2)
Pewarnaan Negatif
- Disiapkan alat dan bahan yang akan digunakan
- Dibersihkan objek gelas dengan alkohol hingga
bebas lemak
- Diambil satu ose suspensi bakteri Bacillus
subtilis atau satu tetes suspensi bakteri Bacillus subtilis dengan
menggunakan spoit, secara aseptis
- Suspensi bakteri tadi diletakkan di atas
objek gelas, difiksasi
- Kemudian ditambahkan 1 tetes nigrosin,
diambil objek gelas yang lain dan dimiringkan di atas dan secara perlahan-lahan
dibuat pulasan hingga membentuk lapisan tipis
- Diamati bentuk morfologinya dengan menggunakan
mikroskop dan digambar hasil pengamatannya
- Hal yang sama juga dilakukan pada bakteri Escherichia
coli
3)
Pewarnaan Kapsul
- Disiapkan alat dan bahan yang akan digunakan
- Dibersihkan objek gelas dengan alkohol hingga
bebas lemak
- Diambil satu ose suspensi bakteri Bacillus
subtilis atau satu tetes suspensi bakteri Bacillus subtilis dengan
menggunakan spoit, secara aseptis
- Suspensi bakteri tadi diletakkan disebar dan
dibiarkan kering di udara
- Kemudian difiksasi di atas lampu spiritus
- Ditambahkan 2-3 tetes kristal violet, dan
dibilas dengan larutan CuSO4
- Diserap dengan kertas uap
- Diamati bentuk morfologinya dengan menggunakan
mikroskop dan digambar hasil pengamatannya
4)
Pewarnaan Gram
- Disiapkan alat dan bahan yang akan digunakan
- Dibersihkan objek gelas dengan alkohol hingga
bebas lemak
- Diambil satu ose suspensi bakteri Bacillus
subtilis atau satu tetes suspensi bakteri Bacillus subtilis dengan
menggunakan spoit, secara aseptis
- Suspensi bakteri tadi diletakkan di atas
objek gelas
- Kemudian ditambahkan 2-3 tetes kristal violet,
dicuci dengan air mengalir
- Ditambahkan lagi dengan 1 tetes larutan mordan,
dicuci dan dikeringkan.
- Ditambahkan 1 tetes etanol 96%, dicuci dan
dikeringkan
- Dan kemudian ditambahkan 1 tetes safranin
- Diamati bentuk morfologinya dengan menggunakan
mikroskop dan digambar hasil pengamatannya
- Hal yang sama juga dilakukan pada bakteri Escherichia
coli
5)
Pewarnaan Spora
- Disiapkan alat dan bahan yang akan digunakan
- Dibersihkan objek gelas dengan alkohol hingga
bebas lemak
- Diambil satu ose suspensi bakteri Proteus
vulgaris atau satu tetes suspensi bakteri Proteus vulgaris dengan
menggunakan spoit, secara aseptis
- Suspensi bakteri tadi diletakkan di atas
objek gelas
- Kemudian ditutup dengan menggunakan kertas
saring
- Ditambahkan dengan 2 tetes larutan hijau
malakit
- Didinginkan dan kertas saring dibuang, kemudian
dicuci dengan air mengalir
- Dan kemudian ditambahkan lagi dengan 1-2 tetes
larutan safranin
- Dikeringkan dan diamati bentuk morfologinya
dengan menggunakan mikroskop serta digambar hasil pengamatannya
6)
Pewarnaan Tahan Asam
- Disiapkan alat dan bahan yang akan digunakan
- Dibersihkan objek gelas dengan alkohol hingga
bebas lemak
- Diambil secara aseptis air steril dan
diletakkan di atas objek gelas, dan satu ose suspensi bakteri Mycobacterium
sp atau satu tetes suspensi bakteri Mycobacterium sp dengan
menggunakan spoit secara aseptis, kemudian diratakan.
- Ditutup dengan menggunakan kertas saring
- Ditambahkan dengan 1 tetes karbol fuksin
- Kertas saring dibuka, dan didinginkan dengan
air mengalir
- Kemudian dicuci dengan alkohol asam dan
pencucian dilanjutkan dengan menggunakan air mengalir
- Ditambahkan dengan 1 tetes metilen biru dan
dicuci dengan air mengalir
- Dikeringkan dan diamati bentuk morfologinya
dengan menggunakan mikroskop serta digambar hasil pengamatannya
BAB V
PEMBAHASAN
Mikroorganisme sulit dilihat dengan
mikroskop cahaya, karena tidak mengadsorbsi ataupun membiaskan cahaya. Alasan
inilah yang menyebabkan zat warna digunakan untuk mewarnai mikroorganisme atau
latar belakangnya. Sebagaimana fungsi dari mikroskop yakni merupakan alat yang
digunakan untuk melihat jasad renik yang sangat kecil yang tidak dapat dilihat
mata dan salah satunya adalah dalam pengamatan bakteri, kita dapat melakukannya
dengan cara pewarnaan atau pengecatan. Kecuali untuk bakteri tertentu yang
jumlahnya sangat terbatas sel mikroba bersifat tembus cahaya. Sehingga sukar
untuk dilihat atau diteliti di bawah alat pembesaran yang sudah ada. Ini
disebabkan karena banyaknya mikroba yang tidak mempunyai butir warna.
A. Pengecatan sederhana
Pada percobaan
yang dilakukan, untuk pewarnaan sederhana bakteri yang diamati yaitu Bacillus
subtilis dan E. coli dan digunakan satu macam zat warna saja yaitu zat warna
metilen biru. Percobaan ini dilakukan dengan mengambil suspensi bakteri yang
diletakkan di atas sebuah kaca objek kemudian difiksasi di atas api dan
ditambahkan zat warna metilen blue, lalu dilakukan pengamatan di bawah
mikroskop. Pada pewarnaan ini yang terwarnai adalah bakterinya, hal ini
disebabkan karena zat warna yang digunakan itu bersifat basa (positif)
sedangkan bakteri umumnya bersifat negatif. Oleh karena itu zat warna dan
bakteri saling berikatan sehingga zat warna tersebut dapat melekat pada dinding
sel bakteri sehingga memberikan warna biru pada bakteri tersebut.
Pengecatan sederhana pada bakteri Bacillus
subtilis menunjukkan bentuk basilus dengan warna ungu, warna ini berasal
dari pewarna kristal violet yang bersifat basa yang bermuatan positif yang mudah berikatan dengan dinding bakteri Bacillus
subtilis bermuatan negatif sehingga menghasilkan pewarnaan pada bakteri
yang lebih kontras dibanding sekelilingnya, sehingga bentuk bakteri lebih mudah
diamati.
Pengecatan sederhana pada bakteri
Escherichia coli menunjukkan bentuk basil dengan warna ungu, warna ini
berasal dari pewarna kristal violet yang bersifat basa dan bermuatan positif
yang mudah terikat dengan bakteri Escherichia coli yang dinding selnya
muatannya negatif menghasilkan pewarnaan pada bakteri yang lebih kontras
dibanding sekelilingnya , sehingga bentuk bakteri lebih mudah diamati.
B. Pengecatan atau pewarnaan
negatif
Untuk pewarnaan
negatif, dilakukan dengan mengambil zat warna terlebih dahulu yaitu nigrosin
kemudian diletakkan diatas kaca objek, setelah itu dicampurkan dengan suspensi
bakteri lalu diratakan. Preparat inilah yang diamati di bawah mikroskop yang
didapatkan hasil yaitu bakteri yang tidak berwarna, tetapi justru lapangan
pandang yang berwarna. Hal ini disebabkan karena zat warna nigrosin yang
digunakan bersifat asam (negatif) sehingga zat warna tersebut tidak terikat
pada dinding sel bakteri yang juga bermuatan negatif, oleh karena itu yang
tampak berwarna adalah lapangan pandangnya.
Pengecatan pada
bakteri Bacillus subtilis menunjukkan bakteri berbentuk batang dan
bersifat transparan. Hal ini karena bakteri Bacillus subtilis merupakan
bakteri gram positif. Zat warna yang digunakan bersifat basa (nigrosin), cat
basa ini bermuatan negatif sehingga susah berikatan dengan dinding sel bakteri
yang bersifat negatif juga, sehingga yang terwarnai adalah latar belakangnya.
Pengecatan pada
bakteri Escherichia coli menunjukkan bakteri berbentuk batang lurus dan bersifat transparan. Hal ini karena
bakteri Escherichia coli mempunyai dinding sel yang bermuatan negatif
yang sulit menyerap cat atau pewarna yang juga bermuatan negatif sehingga
bagian yang terwarnai adalah bagian latar belakang sehingga bentuk bakteri
lebih mudah terlihat.
C.
Pengecatan Gram
Untuk pewarnaan
Gram, dilakukan dengan mengambil suspensi bakteri kemudian diletakkan di atas
kaca objek lalu difiksasi di atas api. Untuk pewarnaan Gram ini digunakan lebih
dari satu macam zat warna, karena itu disebut juga pewarnaan diferensial. Zat
warna pertama yang digunakan yaitu kristal violet (Gram A), kemudian larutan
mordan (Gram B) untuk menguatkan intensitas zat warna pertama, alkohol asam
(Gram C) untuk melunturkan zat warna pertama yang tidak diikat kuat oleh
dinding sel bakteri, dan yang terakhir yaitu safranin (Gram D) sebagai zat warna
penutup. Pada pewarnaan ini dapat dibedakan antara bakteri yang bersifat
Gram-positif dan Gram-negatif, yaitu bakteri Gram-positif berwarna ungu karena
mengikat zat warna pertama yaitu kristal violet, dan bakteri Gram-negatif
berwarna merah karena mengikat zat warna penutup, yaitu safranin. Adanya
perbedaan pengikatan zat warna ini terjadi karena pada bakteri Gram-positif
memiliki dinding sel yang memiliki lapisan peptidoglikan yang tebal sehingga
zat warna pertama yang diserap dan telah dikuatkan oleh larutan mordan tidak
dapat dilunturkan oleh alkohol asam sehingga pada akhirnya yang diamati yaitu
warna ungu dari kristal violet. Sedangkan untuk bakteri Gram-negatif meskipun
memiliki dinding sel yang berlapis, tetapi lapisan paling luarnya yaitu lipopolisakarida
tidak dapat menahan kristal violet setelah ditambahkan zat peluntur yaitu
alkohol asam, sehingga setelah ditambahkan alkohol asam tersebut dinding selnya
tidak berwarna dan dengan penambahan zat warna penutup, yaitu safranin maka zat
warna inilah yang diserap oleh dinding selnya, sehingga pada akhirnya yang
diamati yaitu warna merah dari safranin.
Pengecatan gram
pada bakteri Bacillus subtilis
menunjukkan bahwa bentuk bakteri Bacillus subtilis berbentuk batang
dengan warna ungu, oleh karena itu, bakteri Bacillus subtilis termasuk
bakteri gram positif dimana pewarna tetap terikat pada dinding sel karena
dinding sel yang terdiri dari peptidglikan sehingga pewarna tertinggal pada
dinding sel walaupun diberi pemucat, sehingga setelah ditambah safranin akan
tetap berwarna ungu.
D.
Pewarnaan tahan asam
Untuk pewarnaan
tahan asam dilakukan dengan mengambil suspensi bakteri kemudian diletakkan
diatas kaca objek lalu difiksasi dan ditambahkan zat warna karbol fuchsin dan
dicuci dengan air mengalir dan ditambahkan alkohol
asam, dan zat warna selanjutnya yaitu metilen blue. Prinsip pengikatan zat
warna pada pewarnaan ini sama dengan pada pewarnaan Gram. Hasil akhir yang
diperoleh yaitu, apabila bakterinya tahan asam maka akan berwarna merah dari
karbol fuchsin, dan apabila bakterinya tidak tahan asam maka akan berwarna biru
dari metilen blue. Bakteri Mycobacterium sp, termasuk bakteri yang tahan
asam.
Bagian sel dari bakteri Mycobacterium sp sel-selnya mengandung
lipida-lipida dalam jumlah agak besar sehingga sangat sukar dilakukan
pengecatan sederhana ataupun pengecatan gram, selain itu terdapat pula asam
mycolat yang merupakan salah satu faktor penyebab sukarnya sel-sel mikroba ini
dilakukan pengecatan sederhana. Apabila jenis-jenis bakteri golongan ini dicat
dengan larutan karbol fuksin maka cat tersebut akan diserap dan diikat oleh
sel. Cat yang telah diserap tadi ternyata sangat tahan terhadap pencucian
dengan asam-asam mineral ataupun alkohol asam. Sehingga bakteri ini tetap
berwarna merah.
E. Pewarnaan Spora
Pada pengecatan
ini menggunakan cat safranin dan malakit hijau dimana safranin akan memberikan
warna merah pada bagian induk atau sel vegetatif sedangkan malakit hijau
memberikan warna hijau pada sel anaknya. Pada pewarnaan spora dapat dilihat
bakteri yang berwarna merah yang menunjukkan bahwa bakteri tersebut merupakan
bagian dari sel vegetatif yang bereaksi dengan safranin, tidak didapatkan
bentuk spora dari bakteri Proteus vulgaris yang berwarna hijau (yang
terikat oleh zat warna malachit green) disebabkan karena pada bakteri Proteus
vulgaris ini tidak dapat membentuk spora.
F. Pewarnaan Kapsul
Kapsul adalah
bagian sel yang berbentuk lapisan lendir yang menyelubungi sel bakteri; kapsul
berbeda dengan bahan lendir hasil metabolisme yang merupakan sekresi. Susunan kimia kapsul sangat kompleks
tergantung pada gugus dan spesies bakteri, pada umumnya berupa polisakarida
yang terdiri dari senyawa gula sederhana, senyawa gula amino, senyawa asam gula
(“sugar acids”) atau berupa campuran bahan-bahan tersebut.
Penambahan
kristal violet pada bakteri akan terikat dan dilunturkan dengan
membilasnya pada larutan CuSO4 yang merupakan peluntur kristal
violet, dimana larutan ini merupakan cairan kimia untuk memperjelas warna yang
kita amati dan dalam hal ini tidak digunakan larutan H2SO4
sebagai peluntur warna karena dapat menghilangkan warna pada bakteri. Setelah
dilakukan pengamatan didapatkan latar belakang Acetobacter sp berwarna putih dan sel bakteri berwarna ungu,
sedangkan pada proteus vulgaris berwarna
ungu. tersebut.
BAB V
PENUTUP
VI.1 Kesimpulan
1. Pada pengecatan sederhana, pewarna yang
diberikan pada biakan bakteri yaitu methylen blue dimana Bacillus subtilis terlihat
berbentuk basillus dan bakteri Escherichia coli juga menunjukkan bentuk basil.
2. Pada pengecatan negatif, bakteri yang diamati
adalah bakteri Bacillus subtilis yang berbentuk basillus dan Escherichia
coli basil dimana latar pandangnya
berwarna.
3. Pada pengecatan gram, bakteri yang termasuk
gram positif adalah bakteri Bacillus subtilis, karena dalam dalam
pewarnaan bakteri berwarna ungu
sedangkan bakteri yang termasuk gram negatif adalah bakteri Eschericia coli karena sewaktu
pewarnaan bakteri menunjukkan warna merah.
4. Pewarnaan tahan asam pada bakteri Mycobacterium
sp menunjukkan bahwa bakteri tersebut berwarna ungu yang bereaksi dengan
karbol fuksin dan termasuk bakteri yang tahan asam.
VI.2 Saran
Agar dalam
praktikum, asisten selalu menemani dan mendampingi praktikan.
DAFTAR PUSTAKA
1. MS., Djide, M.Natsir Drs, ; Msi. Sartini, Dra. ;
2006 ; Penuntun Praktikum Mikrobiologi Dasar ; Universitas Hasanuddin ;
Makassar
2. MS., Djide, M.Natsir Drs, ; MS., Ny. Risco B.
Gobel Dra, 1988, Mikrobiologi Umum, Universitas Hasanuddin ; Makassar
3.
MS., Djide, M.Natsir Drs, ; Msi. Sartini, Dra, 2006, Mikrobiologi
Farmasi Dasar, Universitas Hasanuddin, Makassar.
4. Lud Waluyo, 1994, Mikrobiologi
Umum, UMM-Press, Jakarta
5. Lay W. Bibiana, 1994, Analisis
Mikroba di Laboratorium, PT RajaGrafindo Persada, Jakarta
6. Malan Ditjen Pom, (1979), Farmakope
Indonesia, Edisi III, Departemen Kesehatan RI, Jakarta
7. Ditjen Pom, (1979), Farmakope
Indonesia, Edisi IV, Departemen Kesehatan RI, Jakarta
8. Anonim, 1986, Penuntun
Praktikum Mikrobiologi, Departemen Perindustrian, Sekolah Menengah Analis
Kimia, Bogor
9. Suriawiria Unus Drs, 1986, Pengantar
Mikrobiologi Umum, Angkasa,
Bandung
10.Pelczaer
Jr. Michael, dan ECS Chan, 1986, Dasar-Dasar Mikrobiologi, Universitas
Indonesia, Jakarta.
LAMPIRAN
Pewarnaan
Sederhana :
 |
Pewarnaan Negatif :
|
|||||
 |
|||||
|
|||||
Pewarnaan
Kapsul :
 |
|||||||
 |
|||||||
 |
|||||||
 |
|||||||
 |
 |
|||||
 |
|||||
 |
|||||
Pewarnaan
Gram :
 |
|||||||||||
 |
|||||||||||
 |
|||||||||||
 |
|||||||||||
 |
|||||||||||
 |
|||||||||||
 |
||||||||||||||
 |
||||||||||||||
 |
||||||||||||||
 |
||||||||||||||
 |
||||||||||||||
 |
||||||||||||||
 |
||||||||||||||
 |
||||||||||||||
Pewarnaan
Spora :
Pewarnaan
Tahan Asam :
 |
